- G418 Sulfate遺傳霉素（抗生素）
- 型號(hào)：FS0019
- 報(bào)價(jià)：400
- 地區(qū)：上海
- G418 Sulfate遺傳霉素（抗生素），CAS:108321-42-2也稱(chēng)作Geneticin（遺傳霉素），是一種結(jié)構(gòu)類(lèi)似于慶大霉素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類(lèi)抗生素，通過(guò)影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來(lái)干擾蛋白合成，對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性 ,包括細(xì)菌、酵母、高等植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng).
- 021-34600120
G418 Sulfate遺傳霉素（抗生素）
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
| 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規(guī)格 | 報(bào)價(jià)（元） |
| FS0019-1G | G418 Sulfate遺傳霉素（抗生 素） | 1g | 400.00 |
| FS0019-5G | G418 Sulfate遺傳霉素（抗生素） | 5g | 1600.00 |
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后 ,使其編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3)II）。此酶通過(guò)共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn)，需要建立殺滅曲線(xiàn)（劑量反應(yīng)曲線(xiàn)）確定殺死無(wú)抗性細(xì)胞的zui低有效濃度。植物細(xì)胞中，通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性，包括G418，卡那霉素和巴龍霉素。
產(chǎn)品屬性：
英文同義名（English synonym） 中文同義名（Chinese synonym） | Antibiotic G418; G418 Sulfate; G418硫酸鹽；遺傳霉素； |
| CAS號(hào)（CAS No.） | 108321-42-2 |
| 分子式（Molecular formula） | C20H40N4O10·2 H2SO4 |
| 分子量（Molecular weight） | 692.7 |
| 外觀(guān)（Appearance） | 白色粉末 |
| 純度（Purity） | ~98% |
活力（Potency）（anhydrous） 溶解性（Solubility） | >700 μg/mg 溶于水 |
| 結(jié)構(gòu)式（Structure） |  |
G418 Sulfate遺傳霉素（抗生素）
運(yùn)輸與保存方法
常溫運(yùn)輸。粉末4℃避光保存，避免受潮，否則會(huì)降低抗生素活力。
使用方法
1. G418儲(chǔ)存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）
1.1活力單位的換算
根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見(jiàn)批次對(duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)際稱(chēng)重的粉末與體積比濃度。
比如若所用批次的G418 活力值為：750 µg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。
如果配制10 mL的G418儲(chǔ)存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱(chēng)取663.3 mg粉末。
1.2除菌和保存
根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱(chēng)重量，加入10 mL無(wú)菌去離子水內(nèi)使其*溶解。
先用5 mL無(wú)菌去離子水預(yù)濕潤(rùn)0.22 μm針頭式過(guò)濾器，除盡水。之后使用此濾器過(guò)濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。
【注】：①不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過(guò)濾，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨?溶解，過(guò)濾過(guò)程中會(huì)造成藥物損失，降低終液的活性。②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl,磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來(lái)制備儲(chǔ)存液。
2. 常用篩選濃度
一般來(lái)說(shuō)，剛開(kāi)始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件，細(xì)胞類(lèi)型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此*次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)殺滅曲線(xiàn)（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線(xiàn)，來(lái)確定篩選濃度。
通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL；
以下是一些細(xì)胞類(lèi)型使用篩選使用的濃度，可做參考:
| 細(xì)胞類(lèi)型 | 激活濃度 | 應(yīng)用 | 引用文獻(xiàn) |
| 網(wǎng)柄菌屬 | a) 10 μg/mL b) 30 μg/mL | a）培養(yǎng)在培養(yǎng)液中； b）培養(yǎng)在凍干細(xì)菌上； | Hirth,et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982). |
| 哺乳動(dòng)物 | a) 400 -1000 μg/mL b) 200 μg/mL | a）用于篩選 b）用于維持生長(zhǎng) | Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982). |
| 植物 | a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/mL | a）用于篩選 b）用于維持生長(zhǎng) | Ursic, et. al., Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981). |
| 酵母 | a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL | a）用于篩選 b）用于維持生長(zhǎng) | Jimenez and Davies, Nature, v. 287, 869-871 (1980). |
| 細(xì)菌 | 8-16 μg/mL | 用于篩選 | Waitz, et. al., Antimicrob. Agents Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974). |
3. 殺滅曲線(xiàn)的建立
【注】：為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素zui低濃度，可通過(guò)建立殺滅曲線(xiàn)（劑量反應(yīng)曲線(xiàn)）來(lái)實(shí)現(xiàn)，至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性強(qiáng)，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。
1) *天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過(guò)夜；
【注】：對(duì)于需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。
2) 根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3) 第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。
4) 接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選
4.1 轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來(lái)傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
【注】：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果超好。則當(dāng)細(xì)胞過(guò)于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，將細(xì)胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。
4.2 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
4.3 篩選7天后觀(guān)察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類(lèi)型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。
4.4 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。
4.5 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
注意事項(xiàng)
1) 本品不可高壓滅菌；
2)不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因?yàn)樗鼈兪荊418的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其他的抗生素也會(huì)產(chǎn)生交叉活性。
3) 配制G418溶液時(shí)，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來(lái)進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液以及工作液。
4) G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過(guò)低，或者細(xì)胞密度過(guò)高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。
5) 即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。
6) 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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